Il est né le 23 Mars 1973 à Minneapolis dans le Minnesota.

Après deux années dans la compagnie théâtrale du Gutrie Theater dans sa ville natale de Minneapolis, T.R. Knight s'installe à New York où il s'illustre à Broadway dans la pièce Noises Off (2001) face à Peter Gallagher, puis dans Tartuffe. Il apparaît à la télévision à partir de 2003 en tant que personnage régulier dans l'unique saison de la série Charlie Lawrence. Il enchaîne avec des rôles de guest-star dans Frasier (2003), New York Section Criminelle (2004) et Les Experts avant de s'établir au Seattle Grace Hospital dans la série à succès Grey's Anatomy (2005) sur ABC.